DESCRIPCIÓN

Las AB son compuestos nitrogenados de bajo peso molecular que se forman por decarboxilación de determinados aminoácidos mediante la acción de enzimas producidas por microorganismos presentes en los alimentos. Estos microorganismos pueden ser contaminantes, pero también pueden formar parte de los cultivos iniciadores utilizados en la producción de alimentos y bebidas fermentadas. La ingestión de alimentos con niveles altos de AB puede ocasionar graves trastornos, llegando incluso a comprometer la vida del consumidor, especialmente en aquellas personas con deficiencias en la actividad amino-oxidasa intestinal, enzima responsable de su detoxificación.

Además, las AB son precursoras de las nitrosaminas, de conocido efecto cancerígeno. Por todo ello, las autoridades alimentarías recomiendan evitar la presencia de AB en alimentos y bebidas. Con el fin de garantizar las cualidades sanitarias de los alimentos y bebidas fermentadas, se debería de evitar la inclusión en los cultivos iniciadores de aquellas cepas cuya actividad metabólica pueda dar lugar a la formación de AB. La capacidad para formar AB no es una característica de una especie bacteriana sino de cepas que tienen los genes que codifican los enzimas y las proteínas necesarias para su síntesis.

Mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es posible amplificar de forma específica una porción de DNA correspondiente a los genes responsables de la síntesis de tiramina y por lo tanto detectar aquellas cepas potencialmente productoras de esta AB. Uno de los criterios de selección de los microorganismos que forman parte de los cultivos iniciadores de alimentos y bebidas fermentadas es su inocuidad, de forma que esté garantizada la calidad sanitaria del producto final. Esta necesidad, en combinación con la demanda de métodos cada vez más rápidos y sensibles que puedan ser fácilmente aplicados en cualquier punto de la cadena alimentaria hace de la reacción de PCR un método atractivo para la detección de cepas productoras de tiramina.

La presente invención permite la identificación de BAL productoras de tiramina de forma rápida y sensible por PCR, mediante el uso de oligonucleótidos cebadores específicos del gen tdcA, que codifica la tirosina descarboxilasa, enzima que cataliza la síntesis de tiramina a partir de tirosina. Estos oligonucleótidos cebadores se diseñaron a partir de la secuencia de nucleótidos del gen tdcA de L. lactis IPLA10000. La comparación de las secuencias de nucleótidos de todos los genes tdcA de BAL, cuya secuencia se conoce hasta la fecha, ha permitido la identificación de regiones altamente conservadas entre los distintos géneros. Estas secuencias son por tanto buenas candidatas para el diseño y la definición de oligonucleótidos cebadores para su uso en reacciones de PCR que permita amplificar un fragmento interno identificativo del gen tdcA y por tanto la determinación de la existencia de bacterias BAL productoras de tiramina.

Puesto que se ha optimizado de forma que no es necesario purificar elo DNA de las cepas que se pretenden ensayar (una colonia aislada puede ser utilizada directamente en la reacción), el método propuesto es rápido y sencillo. Por otra parte, la técnica propuesta de PCR ofrece la posibilidad de detectar cepas productoras de tiramina en leche, en cualquier punto de la fermentación de la leche y en productos finales tales como queso.

ASPECTOS INNOVADORES

En la actualidad se usan dos tipos de métodos para la detección de AB:

• Microbiológicos. Se basan en el crecimiento de los microorganismos en medios diferenciales, con un indicador de pH y en presencia del aminoácido que actúa como sustrato de la reacción de decarboxilación que da lugar a la AB correspondiente. Sus principales inconveniente son la dificultad para el crecimiento en estos medios de algunas cepas de BAL productoras de aminas y los largos períodos de incubación necesarios (72 horas).

• Técnicas cromatográficas (HPLC). En este caso hay que tener en cuenta que la producción de estos compuestos está inducida por determinadas condiciones ambientales, como por ejemplo la presencia del aminoácido sustrato o la acidez del medio, por lo que un resultado negativo en el momento de realizar el análisis no puede garantizar la seguridad de la cepa ensayada, ya que en condiciones distintas si podría producir AB que se acumularían en el alimento o bebida correspondiente. Además, detectan la presencia de estos compuestos al final del proceso productivo y por lo tanto no se puede evitar la pérdida del producto final con el consiguiente perjuicio económico.El procedimiento que se propone, además de solventar los inconvenientes de estas técnicas, presenta las siguientes ventajas:

• La especificidad, ya que para la amplificación por PCR se utilizan oligonucleótidos específicos para el gen tdcA, que es el responsable último de la síntesis de tirosina.

• La sencillez. En general la PCR es una técnica muy sencilla y en este caso en particular se ha optimizado de forma que ni siquiera es necesario aislar el material genético para usarlo como muestra, ya que una colonia aislada o directamente la leche, en cualquier punto de fermentación, pueden ser utilizados directamente en la reacción.

• La altísima sensibilidad. Las BAL producen concentraciones de tiramina detectables por HPLC cuando están presentes en concentraciones de 107 ufc ml-1. Nuestro método permite detectar 104 ufc ml-1.

• La rapidez. En menos de 4 horas se puede saber si una cepa es potencialmente productora de tiramina o determinar la presencia de cepas productoras de tiramina en una muestra alimentaria.

VENTAJAS COMPETITIVAS

Las empresas que producen alimentos están obligadas a garantizar la calidad sanitaria del producto final y por lo tanto deberían evitar la presencia de AB en los alimentos. Además, los consumidores cada vez exigen un mayor control sanitario de los alimentos que consumen, por lo que cuantos más y mejores mecanismos de control apliquen, más competitivas serán. El método desarrollado aporta ventajas sobre los métodos convencionales, tales como mayor especificidad y sensibilidad, lo que redundará en una mayor seguridad de los alimentos producidos y por lo tanto en una mayor competitividad. Por otro lado, aporta sencillez, de forma que no sería necesario personal altamente cualificado para su aplicación, y rapidez, lo que en la industria siempre supone una reducción de costes.

PALABRAS CLAVE

Bacterias del ácido láctico, aminas biógenas, tiramina, gen tirosina descarboxilasa, detección PCR

SOLICITUD DE PATENTE

P200302572, solicitada a 04-11-2003

PERSONA DE CONTACTO

Estrella Maroto
mail: e.maroto@orgc.csic.es
teléfono: +34 91 585 52 51

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